下一代蛋白质组学
2019-04-04

本文涉及产品列表:

Spectronaut(DIA分析软件)

SpectroMine(DDA分析软件)

SpectroDive(PRM/MRM分析软件)

Peaks Studio(Denovo,DDA/DIA综合分析软件)

下一代非标记定量蛋白质组学

我们提供一系列基于质谱的生物样本数字化产品,助您迈向蛋白质组学的下一时代。通过我们集成的整体解决方案,您可以轻松地实行各种蛋白质组学研究流程。取决于您的研究方向,可以选择发现式研究方案,剖析不同条件及处理下样品的成千上万种蛋白;亦或是靶向研究方案,对选定的蛋白质进行高通量定量。

1.jpg

发现式蛋白质组学

超反应监测(HRM, Hyper Reaction Monitoring)是发现式蛋白质组学中最新的一类技术。它能够提供无与伦比的蛋白质组覆盖,同时实现每个样品9000种蛋白质(人类细胞)的精确、高度可重复的定量。HRM流程提供一个理想的差异表达蛋白质组定性分析或海量样品的蛋白质组定量平台。

HRM流程基于三个必要步骤:
• 构建谱图库:图库收集了样本所有可检测的非冗余的高质量肽段信息(MS/MS谱图),用于后续数据分析的肽段鉴定模板。其中包含描述肽段谱峰特性的碎片离子强度和保留时间 (iRT)。谱图库通过对感兴趣的样品进行data dependent acquisition (DDA)检测采集。
• DIA模式下获取大量样本数据:Data independent acquisition (DIA,又称 SWATH)模式利用最新的高分辨质谱实现在质量数和保留时间上同时采集肽段离子特征。与传统的提取单一离子进行碎裂分析的方法相比,DIA模式下质谱被设定为宽母离子窗口循环采集并同时碎裂多种肽段离子的分析方式。实现了将样品中所有可检测的蛋白谱峰信息完整采集, 从而能够高重复性的分析大量样本。
• 数据分析:在基于DIA的发现式的蛋白质组研究中,如何更好地进行蛋白检测和定量目前依然是个巨大的挑战。采集自肽段的信息虽然十分完整,但发生高度卷积。我们可以利用高质量谱图库中的肽段谱峰进行进行分析,但在统计分析和定量前,必须首先进行有效地去卷积。而这一步操作目前完成的最好的软件即为Spectronaut。

HRM之于常规“shotgun”蛋白质组技术的优势在于可以在单次检测实验中对所有可检测的肽段进行高灵敏高精确度的进行定量。HRM实验结果是一个简单而完整的数据矩阵,包含了各个样品中各蛋白的精确定量信息,从而各种背景的研究者都能直接用其进行深度解析而不需要质谱专家的辅助。HRM进一步能够将一个物理样品转换成数字化蛋白质信息库,这意味着在之后的研究中,我们可以随时对数据进行回溯和重新解析,而不需要再次对其进行数据采集。

我们的发现蛋白质组学解决方案整合了Biognosys公司的Hyper Reaction Monitoring (HRM-MS™),可在一次实验中以DIA模式(DIA或SWATH)精确定量大量蛋白。实验套装可无缝衔接HRM实验流程的各个环节。

2.jpg

下一代靶向定量蛋白质组学

靶向蛋白质组学

我们的靶向蛋白质组学流程预先设计了一套可以在海量样品中对150个已知蛋白质进行绝对定量的方案。HRM技术(Hyper Reaction Monitoring,超反应监控)需要对所有肽段和碎片离子进行采集,靶向蛋白质组只对需要进行检测和关注的肽段进行质谱采集并分析定量,这样可以对成百上千个样品实现更高灵敏度和精确度的定量。在将稳定同位素标准品添加到样品后,靶向蛋白质组允许对感兴趣的蛋白质进行绝对定量。
靶向蛋白质组学目前主要有两类技术:多反应监测和平行反应监测(MRM和PRM)。MRM是一项经典的靶向蛋白质组检测技术,主要依赖三重四级杆质谱。而更加新的PRM技术则依赖于新一代高分辨Orbitrap质谱仪。
SRM(选择反应监测,也称为MRM)是靶向蛋白组学的金标准,而它的衍生技术,PRM(平行反应监测)则在最近刚刚兴起。PRM技术依赖于高质量精度/高分辨率的质谱仪,因此其靶向定量的结果与SRM相比而言,选择性更高,灵敏度更佳,重现性更好,在复杂背景中的抗干扰能力更强。在实际操作方面,PRM比SRM更简单,成本更低,主要表现在:
1) 不需要预先设计靶向蛋白质的母离子/子离子配对信息,节约实验设计和操作时间;
2) 可根据需要选择是否加入合成的标准肽段,可在很大程度上节约实验成本。

在应用方面,PRM可替代传统的Western blot技术,一方面,使蛋白质验证不再受制于商业化抗体,可以应用于多种非模式生物,另一方面,是抗体验证能够高通量的在大规模生物样本上进行,提高实验效率。

3.jpg

靶向蛋白质组技术流程分为三个步骤:
• 方法开发建立:靶向蛋白质组学分析的第一步就是针对目标样品开发合适的分析流程并用HRM方式构建相应的谱图数据库。针对感兴趣的蛋白质,需要建立并优化一系列检测方式(也称为transition或exclusion lists)。预分析需要获得肽段谱峰的特征信息,如碎片离子强度和保留时间 (iRT),这些结果是正式实验数据采集的参考。
• 采集数据:采集数据会用到三重四级杆质谱 (MRM) 或高分辨Orbitrap质谱 (PRM)。这两种方法都需要用前置的四级杆挑选来自于预实验的目标离子,紧接着将离子引入碰撞室。MRM方法仅在第三个四级杆中检测预先选择好的离子,而PRM则会用其高分辨检测器检测所有碎片离子,从而在单次分析中定量到更多的蛋白质。
• 数据分析:大规模样品的数据分析一直是MRM和PRM的短板,需要研究者输入大量的参数进行优化分析。Biognosys开发的SpectroDive克服了这些挑战,其拥有目前最智能化的谱峰提取算法,并能够实现大规模样品的自动化分析。

Biognosys的靶向蛋白质组学分析平台是目前大规模样品、大量蛋白质验证研究中最新最先进的分析工具。凭借独特的iRT概念,研究人员可以在单次实验中对多达100个目标蛋白质进行6个数量级的动态范围内的绝对定量。我们可以为您提供一应整合的实验工具包及软件。

4.jpg

indexed retention time (iRT)

Biognosys引入的indexed retention time (iRT)概念在定量研究中获得了优异的结果。通过iRT能够高精度的预测任何色谱系统中肽段的保留时间。和肽段的分子量相似,其色谱保留时间理论上也应该有一个稳定的特征属性。但是,实际的肽段保留时间(RT) 随着色谱系统的不同差别很大。iRT实现了在任何液相色谱系统中将肽段保留时间特征转换成精确可预测的时间信息。从而在MRM, PRM 和HRM分析中,实现更多蛋白质的同时定量(可同时定量近150种蛋白质),并改善谱峰提取和打分效果。

针对HRM流程的DIA或SWATH分析,Biognosys最近新开发了一种用于高精度预测肽段保留时间的方法,称作high-precision iRT。该方法从原来的11个iRT肽段扩展为来自实际样品的上千个肽段信息,并储存于Spectronaut这款专业分析DIA/SWATH数据的软件中。high-precision iRT相对于最初的iRT方法大约能增加15%的定量信息,而相对于传统的无保留时间预测的谱图数据库匹配方式则提高了25%。(Bruderer et al. 2016)

111928_6411.png

靶向定量平行反应监测(PRM)

6.jpg

基于高效液相色谱的鸟枪法蛋白质组学(LC-MS/MS)具有强大的蛋白质定性能力,但是在蛋白质定量上,其灵敏度仍待提高。而近来兴起的靶向蛋白组学技术,在蛋白质定量上灵敏度更佳,重现性更好。如果鸟枪法蛋白质组学是对样品进行大规模的盲筛,那么靶向蛋白质组学就是有针对性的对一组已知的感兴趣蛋白质,进行高质量的靶向定量。

SRM(选择反应监测,也称为MRM)是靶向蛋白质组学的金标准,而它的衍生技术,PRM(平行反应监测)则在最近刚刚兴起。PRM技术依赖于高质量精度/高分辨率的质谱仪,因此其靶向定量的结果与SRM相比而言,选择性更高,灵敏度更佳,重现性更好,在复杂背景中的抗干扰能力更强。在实际操作方面,PRM比SRM更简单,成本更低,主要表现在:
1) 不需要预先设计靶向蛋白质的母离子/子离子配对信息,节约实验设计和操作时间;
2) 可根据需要选择是否加入合成的标准肽段,可在很大程度上节约实验成本。

在应用方面,PRM可替代传统的Western blot技术,一方面,使蛋白质验证不再受制于商业化抗体,可以应用于多种非模式生物,另一方面,使抗体验证能够高通量的在大规模生物样本上进行,提高实验效率。

上一篇: [上一篇] 没有了