Limited Proteolysis
2018-12-12

LiP技术

许多外界干扰都能影响蛋白质的构象,诸如热刺激,蛋白-蛋白相互作用,化合物结合,翻译后修饰等。蛋白构象的变化包括局部波动,形成更大的结构域,折叠构象与非折叠构象,或者单体与多体间的转换等。蛋白结构的变化会影响蛋白功能,例如变构酶的结构变化调控酶的活性。在淀粉样变性病以及一些神经退行性疾病中,某些蛋白的结构变化会导致其形成不溶性沉淀,对细胞及组织造成伤害。

X-ray 结晶、核磁共振(NMR)以及各种光谱学技术能够在体外研究简单蛋白体系的构象变化,却不能胜任复杂生物体系。Forster共振能量转移(FRET)以及细胞内的NMR技术能够在体内监测特定蛋白的构象变化,但这两种技术都需要对蛋白进行标记,不适合大规模研究。基于质谱的蛋白质组学通常被用来研究蛋白丰度的变化,翻译后修饰以及蛋白-蛋白相互作用,殊不知该技术也能高通量研究复杂生物体系中的蛋白结构的变化,而实现该目的需要结合由瑞士分子系统生物研究所(ETH)的Paola Picotti团队开发的limited proteolysis (LiP)技术。本文就为您介绍如何结合该技术及SRM、PRM、DDA、DIA等蛋白质组学技术研究蛋白结构的变化。

LiP-MS原理

LiP-MS检测蛋白构象变化的关键在于LiP技术。该技术的核心是让蛋白处于天然构象的条件下,用广谱性的蛋白酶对其进行酶切。当蛋白构象发生变化时(例如与小分子结合),会暴露出不同的广谱性蛋白酶酶切位点,产生不同的蛋白酶切片段。一次酶切后再将蛋白样品变性,用胰酶进行二次酶切。通过质谱检测,比较不同处理条件的样品中,全酶切及半酶切肽段(LiP酶切)的信号强度变化,进而分析蛋白构象变化(图1)。

图1. 不同构象下,全酶切肽段与半酶切肽段信号强度比较

LiP-MS 工作流程

LiP 样品制备(举例细胞样品):
1. 准备不同处理条件下的样品。Condition1, Condition2, Condition3…
2. 非变性条件下提取蛋白。
细胞裂解液可以选择50mM Hepes, 150mM KCl, 1mM MgCl2, 100mM β-glycerophosphate, 50mM NaF, pH 7.3。机械力破碎或者反复冷冻破碎。3000g,4s℃,离心2min,收集上清。
3. 向蛋白样品中加入广谱性的蛋白酶。
例如蛋白酶K(常用),thermolysin (嗜热菌蛋白酶),subtilisin (枯热杆菌蛋白酶)、papain(木瓜蛋白酶)、糜蛋白酶(chymotrypsin)、或者弹性水解酶(elastase)。这些蛋白酶倾向于剪切未折叠的蛋白区域。酶与蛋白样品的比例要低,例如1:100。酶解时间要短,例如室温酶解5min。在广谱性蛋白酶作用下,这些非变形的蛋白样品会被切割成大的蛋白片段(图2中红色箭头为广谱性酶作用位点)。
4. 蛋白变性,终止酶解反应。
向非变性的蛋白样品中,加入盐酸胍酶至终浓度为7.4M,并且加热3min, 使蛋白样变性并且终止广谱性酶的酶解反应。
5. 胰酶酶解。
将上述变性的蛋白样品按常规流程进行还原、烷基化、胰酶酶解,即加入12.5Mm DTT, 37℃,30min,加入40mM IAA, 室温避光反应45min。样品用100mM NH4CO3 将盐酸胍酶稀释至0.5M, 按酶与底物1:100 (w/w) 加入测序级胰酶,37℃,反应2h,之后再次加入等量胰酶,37℃酶解过夜。
6. 酶解终止。向样品中加入甲酸至pH<3,肽段脱盐干燥,质谱检测。
7. 需要注意的是,每个条件下蛋白样品均需要设定一个对照组,该对照组仅按照常规蛋白组样品制备流程进行变性、还原、烷基化和胰酶酶解(步骤5)。该对照组用于后续数据分析的归一化。不同条件下蛋白构象的变化,在两步酶切中,会产生不同酶切形式的肽段,通过比较肽段的不同酶切模式,可以研究蛋白构象的变化(图2)。
Mass Spectrometry 检测:
LiP得到的肽段样品,根据实验目的,可以依赖多种质谱检测手段进行检测,包括大规模筛选模式(DDA,DIA),或者靶向模式(SRM,PRM)。液相梯度按照常规2~3h分离,质谱检测参数按照常规DDA,DIA, SRM 及PRM 检测模式设置。搜库软件及参数也同常规。需要注意的是,搜库参数中,胰酶酶切需要设定为半酶切模式。定量时选择半酶切且没有漏切的unique肽段,差异倍数至少2倍以上,q<0.02。通常经DDA/DIA筛选得到的构象变化的肽段,需要经靶向验证。
1. Label free DDA 定量:可采用spectra counting 模式,也可采用峰面积模式。
2. DIA定量:采用峰面积模式。
3. SRM、PRM:采用子离子的峰面积模式。

图2. LiP 工作流程
Condition1中的蛋白暴露出蛋白酶K的酶切位点,因此在质谱中可以检测到两个半酶切的肽段。

LiP-MS技术研究蛋白构象的优势

1. 研究体系可以为复杂生物样本,例如细胞、血液、组织。
2. 样本不需要经过富集、提纯及标记。目前在人源细胞中,可检测到约3500个LiP切割位点,包含约1200个蛋白。
3. 可以联合多种质谱检测技术:靶向(PRM,SRM),定性定量(DDA, DIA)。
4. 可以研究特定蛋白的构象变化,也可以高通量研究蛋白网络中的构象变化。
5. 检测灵敏度高,可以检测显著的结构变化,也可以检测微小的结构变化。如果结合更长色谱梯度,可以检测低丰度蛋白的构象变化。

LiP-MS技术的应用

1. 分析翻译后修饰引起的蛋白构象变化;
2. 分析蛋白酶活性的变化(构象变化会导致酶活性的改变);
3. 分析蛋白-蛋白相互作用及网络;
4. 分析蛋白-(代谢、药物)小分子的相互作用及网络;
5. 疾病生物标志物发现(例如神经退行性疾病,淀粉样蛋白/可溶性蛋白的比例)。

LiP-MS技术应用中的注意要点

1. LiP技术必须在非变性条件对蛋白进行酶切,因此只适合与可溶性蛋白,对膜蛋白不适用。
2. 同一体系中,如果某一蛋白存在多种构象,Lip-MS无法区分各个构象。
3. 某些蛋白无论处于何种构象,对LiP剪切都不敏感,因此无法进行构象分析。

Biognosys 拥有LiP的专利技术,在不久的将来,将会推出商业化的产品为科研领域提供技术支持。该部分在正式购买我们的方案后另行培训,如在试用阶段需要了解结果质量,欢迎联系我们:Support@omicsolution.com。

References:

  1. Protein structure determination by x-ray crystallography. Ilari et al., 2008 Methods. Mol. Biol.

  2. Label-free technologies for target identification and validation. Li et al., 2016 Med. Chem. Commun.

  3. Probing protein structure by limited proteolysis. Fontana et al., 2004 Acta Biochim Pol.

  4. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Feng et al., 2014 Nat Biotech.

  5. A Map of Protein-Metabolite Interactions Reveals Principles of Chemical Communication. Piazza et al., 2018 Cell.

  6. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by immunosuppressant FK506, Xu, et.al-, 2002, Transplantation.


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