Spectronaut应用案例:DIA-磷酸化蛋白质组定量
2018-08-14

蛋白磷酸化修饰是生物体内非常重要的一种翻译后修饰,在生命体生老病死的过程中扮演者举足轻重的角色。过去几十年,随着液相串联质谱技术(LC-MS/MS)的日益精进,研究者已经能够鉴定数千个磷酸化位点。但如何更深入的解析磷酸化蛋白组学,仍需更好的富集、分离以及检测技术。本文给大家介绍了一种更省时间、磷酸化鉴定率更高、重现性更好液相质谱方法,该方法依赖于1)更优化的磷酸化富集手段; 2)更精进的质谱仪;3)更优异的质谱检测技术。

让我们来具体看看这些究竟是什么:

1) 更优化的磷酸化富集手段:相比传统的依赖TiO2的磷酸化肽段富集策略,本文采用Ti-IMAC beads,更方便快捷,样品起始用量低(仅为200ug),且富集效率更高。采用15分钟短液相梯度,更省时。
2) 更精进的质谱仪:采用Thermo Fisher 2017年最新推出的Orbitrap系列超高分辨质谱Q-Exactive HF-X,该质谱仪具有更快速度和更高灵敏度,比上一代Q-Exactive HF性能更为优化。15000分辨率下扫描速度能够达到28Hz。
3) 更优异的质谱检测技术及数据分析手段:采用单针注射(single shot)DIA技术,15min梯度,m/z range:472-1145,15000分辨率,48个窗口,每个窗口15m/z, 1Da overlap。采用DDA技术建立谱图库,并利用Spectronaut 进行DIA数据分析。

采用上述方法,磷酸化富集的样品起始用量更低,磷酸化肽段鉴定重现性相比DDA更高(两次技术重复可由78%提高至84%),在15min短梯度内能够鉴定到~7000个磷酸化肽段,比DDA技术提高约3倍。

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