蛋白质相互作用分析

目录

1. Co-IP+LC-MS:高通量蛋白质相互作用分析
2. SILAC细胞蛋白质表达差异谱定量分析
3. SILAM:模式生物SILAC蛋白质差异表达谱分析
4. Super-SILAC:人体组织样本SILAC蛋白质表达差异谱分析
5. SILAC + Co-IP + LC-MS:蛋白质相互作用定量分析

电子版文档:蛋白质相互作用分析

Co-IP+LC-MS:高通量蛋白质相互作用分析

背景介绍

• 蛋白质是细胞的功能分子,通过实时、动态、交互式的蛋白质相互作用网络(Protein-Protein Interaction network, PPIs),以实现细胞对外界不同刺激的应答。
• 免疫共沉淀(Co-IP)和pull-down技术是研究蛋白质相互作用的经典方法。传统的Co-IP/pull-down结合Western Blot (WB)通常只能一次确认一对相互作用。然而,在细胞中,一个蛋白质往往是和多个蛋白质相互作用,形成相互作用复合物(Protein Complex),以实现特定的生理功能。传统的Co-IP/pull-down + WB无法实现对蛋白质复合物的鉴定。
• 将Co-IP/pull-down技术与LC-MS为基础的蛋白质组学技术结合,通过一次实验,能高通量的鉴定和筛选到多个与要研究的目的蛋白(bait)存在相互作用的蛋白质(蛋白质复合物组分), 从而拥有属于自己的专属蛋白质相互作用数据库,通过深入的生物学分析,能发表多篇连续性的学术文章。

技术路线

co-ip_lc-ms

SILAC细胞蛋白质表达差异谱定量分析

背景介绍

• 氨基酸是蛋白质合成的基本元件。Lys(K)、Arg(R)是哺乳动物细胞的“必需氨基酸”,须在培养基中添加K和R,便于细胞进行蛋白质合成,促进细胞增殖。天然的K和R分子中,都含有6个C原子,这些C原子全部是12C(12C6-K、12C6-R ) 。将普通K和R中的6个12C原子全部用13C取代,则生成13C标记的K和R ( 13C6-K、13C6-R)。13C6-K和13C6-R要比相应的普通K和R(12C-R,12C-K)在质量上增加6Da。我们将普通的K和R记为K0,R0;13C6-R和13C-K6,记为K6,R6。
• SILAC(Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture)技术就是利用哺乳动物细胞生长对K和R的依赖原理,将K6、R6加入细胞培养基中,在细胞进行蛋白质合成肘,K6、R6自然被“掺入”到蛋白质中。通过>6代的细胞增殖,整个细胞的蛋白质都会被K6,R6所标记,从而将6Da的质量差异引入到了蛋白质的K和R氨基酸上,成为后续MS定量的基础。
• 比如,要比较2组细胞的蛋白质表达谱的差异,将一组细胞用普通培养基培养(K0R0,Light,L),一组细胞用SILAC培养基培养(K6R6,Heavy,H)。分别提取蛋白质,1:1等量混合后进行SDS-PAGE电泳。将相应的SDS-PAGE条带切下后,用trypsin进行酶解,生成以K和R结尾的肤段。对于2组样品中的同一个蛋白质的、同一条肽段,它们之间有6Da的质量差异。该6Da的质量差异,在高分辨率的MS中能被有效区分出来,呈现出一对同位素质谱峰(paired peaks),质谱峰的信号强度的比值代表该肽段(蛋白质)在2组细胞中的表达水平差异比值,从而实现对蛋白质表达水平的相对精确定量;
• 利用SILAC技术结合LC-MS能够定量比较细胞在不同状态下的蛋白质组差异(normal vs. treatment),通过MS的定量信息,快速筛选差异表达的蛋白质(不变、上调和下调)。同时将SILAC与Co-IP /pull-down等技术结合,能进行蛋白质相互作用、蛋白质翻译后修饰等定量分析,快速筛选特异性的相互作用和翻译后修饰的相对程度等;
• SILAC实验从最源头引入质量差异,最大程度的降低了实验系统误差,定量信息丰富,准确度高。SILAC技术“高、大、上”,使用SILAC技术,能显著的提高文章的档次。

技术路线

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SILAM:模式生物SILAC蛋白质差异表达谱分析

背景介绍

• SILAM(Stable Isotope Labeling of Mammals):利用SILAC技术对活体小鼠进行完全标记,则此标记的小鼠的任何部位的组织可以作为内参(Reference)。利用SILAC技术原理结合LC-MS/MS,即可高通量的实现对您的小鼠模型特定组织蛋白质组变化的定量分析,筛选差异表达的蛋白质分子。
• SILAC标记的小鼠组织可从Silantes(www.silantes.com)公司采购。该公司除了标记的小鼠组织之外,还有SILAC标记的线虫、大肠杆菌、果蝇、斑马鱼等模式生物标准品出售,为不同领域的研究工作者提供了更多的选择。

技术路线

silam

Super-SILAC:人体组织样本SILAC蛋白质表达差异谱分析

背景介绍

• Super-SILAC:利用SILAC技术实现对人组织样本蛋白质表达谱的定量分析方法。其原理是利用SILAC标记的细胞株的蛋白质作为SILAC内参(reference),利用LC-MS,定量比较分析人体组织(正常组织、肿瘤组织)中的蛋白质表达谱差异。
• 制备super-SILAC mix时,细胞株数目须≥5种,以降低细胞差异导致的系统误差;
• 以super-SILAC mix为参照(reference),可以对多个组织样本的蛋白质表达谱进行定量比较分析,即以super-SILAC为内参,先分别与多个组织样本进行比较分析,最后通过super-SILAC mix为中介,相对比较不同组织样本中蛋白质表达谱差异。
• Super-SILAC是经典SILAC技术(细胞水平)的应用扩展。

技术路线

super-silac

SILAC + Co-IP + LC-MS:蛋白质相互作用定量分析

背景介绍

• Co-IP纯化蛋白质复合物时,非特异性的粘附蛋白是不可避免的。在后续的LC-MS鉴定时,这些非特性的蛋白质会被高频率的检测到。这就带来了一个很困扰的问题:由于没有定量信息,在众多的(500-1000个)、鉴定到的蛋白质中,如何排除非特性的粘附蛋白,找出真正的特异性相互作用;
• 将SILAC和Co-IP技术相结合,借助SILAC引入质量差异,利用Co-IP纯化蛋白质复合物,后续在LC-MS分析时,借助SILAC引入的质量标签实现对蛋白质的定量分析,从而直接将真正的特异性相互作用从非特异性的背景蛋白质中区分出来;
• SILAC定量信息的引入,能快速筛选和锁定特异性的相互作用分子,后续生物学验证成功率明显提高;
• 技术和实验方案“高、大、上”,能显著提高文章的档次。

技术路线

silac_co-ip_lc-ms

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