下一代靶向定量蛋白质组学

靶向蛋白质组学

我们的靶向蛋白质组学流程预先设计了一套可以在海量样品中对150个已知蛋白质进行绝对定量的方案。HRM技术(Hyper Reaction Monitoring,超反应监控)需要对所有肽段和碎片离子进行采集,靶向蛋白质组只对需要进行检测和关注的肽段进行质谱采集并分析定量,这样可以对成百上千个样品实现更高灵敏度和精确度的定量。在将稳定同位素标准品添加到样品后,靶向蛋白质组允许对感兴趣的蛋白质进行绝对定量。
靶向蛋白质组学目前主要有两类技术:多反应监测和平行反应监测(MRM和PRM)。MRM是一项经典的靶向蛋白质组检测技术,主要依赖三重四级杆质谱。而更加新的PRM技术则依赖于新一代高分辨Orbitrap质谱仪。
SRM(选择反应监测,也称为MRM)是靶向蛋白组学的金标准,而它的衍生技术,PRM(平行反应监测)则在最近刚刚兴起。PRM技术依赖于高质量精度/高分辨率的质谱仪,因此其靶向定量的结果与SRM相比而言,选择性更高,灵敏度更佳,重现性更好,在复杂背景中的抗干扰能力更强。在实际操作方面,PRM比SRM更简单,成本更低,主要表现在:
1) 不需要预先设计靶向蛋白质的母离子/子离子配对信息,节约实验设计和操作时间;
2) 可根据需要选择是否加入合成的标准肽段,可在很大程度上节约实验成本。
在应用方面,PRM可替代传统的Western blot技术,一方面,使蛋白质验证不再受制于商业化抗体,可以应用于多种非模式生物,另一方面,是抗体验证能够高通量的在大规模生物样本上进行,提高实验效率。

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靶向蛋白质组技术流程分为三个步骤:
• 方法开发建立:靶向蛋白质组学分析的第一步就是针对目标样品开发合适的分析流程并用HRM方式构建相应的谱图数据库。针对感兴趣的蛋白质,需要建立并优化一系列检测方式(也称为transition或exclusion lists)。预分析需要获得肽段谱峰的特征信息,如碎片离子强度和保留时间 (iRT),这些结果是正式实验数据采集的参考。
• 采集数据:采集数据会用到三重四级杆质谱 (MRM) 或高分辨Orbitrap质谱 (PRM)。这两种方法都需要用前置的四级杆挑选来自于预实验的目标离子,紧接着将离子引入碰撞室。MRM方法仅在第三个四级杆中检测预先选择好的离子,而PRM则会用其高分辨检测器检测所有碎片离子,从而在单次分析中定量到更多的蛋白质。
• 数据分析:大规模样品的数据分析一直是MRM和PRM的短板,需要研究者输入大量的参数进行优化分析。Biognosys开发的SpectroDive克服了这些挑战,其拥有目前最智能化的谱峰提取算法,并能够实现大规模样品的自动化分析。

Biognosys的靶向蛋白质组学分析平台是目前大规模样品、大量蛋白质验证研究中最新最先进的分析工具。凭借独特的iRT概念,研究人员可以在单次实验中对多达100个目标蛋白质进行6个数量级的动态范围内的绝对定量。我们可以为您提供一应整合的实验工具包及软件。

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indexed retention time (iRT)

Biognosys引入的indexed retention time (iRT)概念在定量研究中获得了优异的结果。通过iRT能够高精度的预测任何色谱系统中肽段的保留时间。和肽段的分子量相似,其色谱保留时间理论上也应该有一个稳定的特征属性。但是,实际的肽段保留时间(RT) 随着色谱系统的不同差别很大。iRT实现了在任何液相色谱系统中将肽段保留时间特征转换成精确可预测的时间信息。从而在MRM, PRM 和HRM分析中,实现更多蛋白质的同时定量(可同时定量近150种蛋白质),并改善谱峰提取和打分效果。

针对HRM流程的DIA或SWATH分析,Biognosys最近新开发了一种用于高精度预测肽段保留时间的方法,称作high-precision iRT。该方法从原来的11个iRT肽段扩展为来自实际样品的上千个肽段信息,并储存于Spectronaut这款专业分析DIA/SWATH数据的软件中。high-precision iRT相对于最初的iRT方法大约能增加15%的定量信息,而相对于传统的无保留时间预测的谱图数据库匹配方式则提高了25%。(Bruderer et al. 2016)

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靶向定量平行反应监测(PRM)

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基于高效液相色谱的鸟枪法蛋白质组学(LC-MS/MS)具有强大的蛋白质定性能力,但是在蛋白质定量上,其灵敏度仍待提高。而近来兴起的靶向蛋白组学技术,在蛋白质定量上灵敏度更佳,重现性更好。如果鸟枪法蛋白质组学是对样品进行大规模的盲筛,那么靶向蛋白质组学就是有针对性的对一组已知的感兴趣蛋白质,进行高质量的靶向定量。

SRM(选择反应监测,也称为MRM)是靶向蛋白质组学的金标准,而它的衍生技术,PRM(平行反应监测)则在最近刚刚兴起。PRM技术依赖于高质量精度/高分辨率的质谱仪,因此其靶向定量的结果与SRM相比而言,选择性更高,灵敏度更佳,重现性更好,在复杂背景中的抗干扰能力更强。在实际操作方面,PRM比SRM更简单,成本更低,主要表现在:
1) 不需要预先设计靶向蛋白质的母离子/子离子配对信息,节约实验设计和操作时间;
2) 可根据需要选择是否加入合成的标准肽段,可在很大程度上节约实验成本。

在应用方面,PRM可替代传统的Western blot技术,一方面,使蛋白质验证不再受制于商业化抗体,可以应用于多种非模式生物,另一方面,使抗体验证能够高通量的在大规模生物样本上进行,提高实验效率。

更多信息及分析案例请参考以下资料:
靶向蛋白质组介绍
PRM靶向定量方案介绍
HRM超反应监测
Targeted Proteomics Course 2016