蛋白酶解

在可以用于蛋白酶解的蛋白内切酶中,胰蛋白酶(丝氨酸蛋白酶)是最常用的,它产生的肽段非常适合于MS(/MS)的分析检测。根据前处理流程,蛋白酶解可以在凝胶或溶液内进行,胶内酶解常用于酶解经二维电泳分离的蛋白,而溶液酶解常用于LC-MS/MS分析。在酶解过程中,蛋白被酶切成有限数目的小片段,这些片段称为肽段,这些肽段的特征质量数和碎裂模式可用于后续蛋白质的鉴定。

溶液酶解:

溶液酶解时必须在蛋白溶解度和酶活性之间做出取舍。当蛋白序列中的胱氨酸和半胱氨酸被还原和烷基化时,蛋白内的二硫键将不可逆地被打开,蛋白三级结构去折叠。还原烷化能使含较多二硫键的蛋白获得更好的鉴定、得到更多的肽段,序列覆盖度更高。如果要进行变性电泳,我们强烈建议在电泳前对蛋白进行还原和烷化,因为凝胶中游离的丙烯酰胺单体会修饰半胱氨酸。

通常情况下,应尽量避免使用去垢剂,但根据裂解物的理化特性,有时也需要有机溶剂和/或变性剂辅助。例如对于那些难溶解或变性的蛋白(如膜蛋白),可以协同使用8M尿酸和蛋白酶Lys-C,之后在稍低浓度的变性剂(2M尿素)中,利用胰蛋白酶进行酶解。酶解后的样品用甲酸进行酸化后,可直接进行LC/ESI-MS分析,但一般建议再做一次除盐。有机溶剂可以增强溶液中疏水蛋白的溶解性及蛋白酶消化,有望将酶解的效果翻倍。为了提升蛋白酶的酶解效果,可以将蛋白酶化学固定或物理吸附于一个固定相中。

胶内酶解:

in-gel-digestion

一维或二维凝胶电泳分离样品后,蛋白由质谱兼容的染色剂进行固定和显影,通常使用考马斯亮蓝,或用无戊二醛的试剂进行银染。显影后,从凝胶上切下蛋白,蛋白条带或斑点脱色和脱水后,进行酶解。

胶条先经乙腈脱水,后续又在含有蛋白酶的酶解缓冲液中溶胀,这一过程有利于蛋白酶在凝胶中的渗透。蛋白酶在凝胶中渗透的各类研究表明,这个过程几乎完全由扩散驱动,因此尽可能地将胶条切小,可以提高酶解效率。

表面活性剂(去垢剂)可以帮助胶内蛋白质的溶解和变性,从而缩短酶解时间,促进蛋白质剪切,增加肽段的提取数量和种类,尤其是亲脂性蛋白,例如膜蛋白。可去除型去垢剂是一类可以在酶解后清除的去垢剂,通常在酸性条件下去除,从而兼容质谱检测。

为确保胶内蛋白的水解效率,通常添加相对高浓度的蛋白酶。随后将蛋白水解后产生的肽段从凝胶中抽提出来,如可使用50%乙腈/5%甲酸作为抽提液,并配合超声。可采用酸性或碱性溶液反复抽提不同理化特性的肽段。

胶内酶解和肽段抽提的效率取决于多种因素,包括:(1) 蛋白和肽段的理化特性(如疏水性、分子量大小、氨基酸序列);(2) 胶条的组成、尺寸和厚度;(3) 提取液的成分(如乙腈的浓度);(4) 蛋白酶的种类及特异性;(5) 反应条件(如温度、时间、蛋白酶和底物的比例);(6) 蛋白染色的方法(如考马斯亮蓝或银染)。

胶内酶解的显著优势是:去垢剂、盐类等污染已经在电泳中去除,因此得到的肽段样品可直接用于(LC/)ESI-MS分析。然而这个方法往往受限于:1)蛋白酶和蛋白无法有效接触;2)肽段无法从凝胶中有效释放;3)凝胶存储不当。溶液酶解是胶内酶解的一个很好的替代方案,溶液酶解后通常用一维或二维LC来有效分离肽段混合物,再进行ESI-MS检测。