蛋白纯度分析

protein-purity-analysis

纯蛋白是指不含有任何可计量杂质的蛋白。任何纯度分析的可靠性取决于使用的分析手段,在选择分析方法时应考虑蛋白本身的结构特性、可用的蛋白量、样品中可能含有的污染物的性质以及预计需要的准确度。

肽含量并不代表肽纯度,它们是两种不同的指标。肽纯度通常利用HPLC测定,表示污染肽段、非目标序列的存在与否。肽的净含量只给出所有肽段与其他非肽段组分的百分比。肽的净含量通过氨基酸分析或紫外分光可以精确测得。在一些需要计算肽段浓度的敏感实验中,这个信息至关重要。

实际分析中,可能只需确保样品中没有影响后续分析的污染物,因此使用目的、蛋白来源、纯化步骤均因依照分析需求而定。

蛋白质纯化和评估的常规方法有:蛋白紫外吸收法,Lowry法和Bradford法,Macro和Micro-BCA,ELISA,SDS-PAGE及相关的染色方法,western blot和qIPCR。

蛋白质在近紫外区280nm处的吸收很大程度上取决于芳香族氨基酸的存在,特别是色氨酸与酪氨酸。吸收率受到pH和离子化强度影响。另外,在这个波长下,核酸往往会带来强烈干扰。

Bradford法基于亮蓝G-250和蛋白在溶液中形成的络合物。当蛋白质与其络合后该染色剂的最大吸收峰从465nm变为595nm,且吸光度与蛋白浓度相关。这是一种快速、简单且低成本的方法并且适用与还原剂兼容(还原剂常被用于稳定蛋白质)。然而Bradford与去垢剂不兼容,哪怕是样品中存在很低浓度的去垢剂,此时建议使用BCA法