蛋白样品制备

在蛋白质组学分析中,样品制备至关重要,我们可以根据您的需求,提供个性化的样品制备服务。

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蛋白质组学旨在研究整个生物体、特定组织或细胞的蛋白质表达量的动态变化。因此蛋白质组学的两个重要目标是1)对复杂混合物中的蛋白质进行定性,2)对蛋白质的表达水平进行定量。除了蛋白质,混合物中往往包含很多其他物质,例如核酸、脂类、糖类及多种小分子。与DNA、RNA不同,蛋白质间的异质性很大,不同蛋白质在分子量大小、电荷、亲疏水性和结构上相差巨大。另外,很多蛋白质具有翻译后修饰,可能结合了多种非肽基团。这样的化学异质性使得蛋白质的分离及其困难。

在蛋白质组学整个分析过程中,样品制备是最敏感的步骤,在此我们给出以下几点建议:
1) 尽可能减少样品处理步骤,以防蛋白损失;
2) 用尽可能低的温度保存样品,以免蛋白质发生修饰并阻止蛋白酶的活性;
3) 尽可能缩短样品制备时间,以免蛋白损失及发生蛋白修饰;
4) 尽可能裂解所有聚合物和复合物;
5) 在不影响蛋白质的情况下尽可能去除所有干扰物;
6) 处理样品有多种方法,在实际操作中不可能获得细胞中的所有蛋白质,一般选择能获取蛋白数量最多的方法。

蛋白质组是不同表达水平的基因产物的集合。对低丰度蛋白进行可靠的定量分析,是蛋白质组学的一个巨大挑战,因此样品的预分馏和蛋白富集技术在样品制备中极为重要。高丰度蛋白,例如肌动蛋白、微管蛋白、人血清白蛋白、补体系统中的蛋白以及抗体等,在匀浆中占据很大一部分比例。因此,那些更能反映细胞活动的低丰度调控蛋白,则需要通过合适的前处理,才能被有效检测。亚细胞分离技术可以富集特定的细胞器及细胞组分,相比匀浆液,能够大大提高蛋白的检测率。不同的亚细胞器不仅仅在蛋白组成上有差异,而且还包含细胞器特异表达的蛋白,这些蛋白可以为各细胞器提供合适的生化环境,从而发挥其特有的生理功能。因此在亚细胞水平上鉴定蛋白是理解细胞功能的第一步。事实上,有些蛋白只在特定生理状态下才和亚细胞结构相关,而在其他状态下则分布在细胞的其他位置。

蛋白质必须从细胞或组织中提取,裂解方法的选择取决于样品种类。最简单的方法是使用标准裂解液裂解培养的细胞,而有坚硬细胞壁的组织和样品常常于零下温度用研钵研磨。

不幸的是,复杂的蛋白混合物在非变性条件下不能得到分离。液态样品必须变性,以防形成多肽低聚体、聚合物或发生相互作用。在7M以上尿素中,大多数多肽仅以一种构形存在。添加载体电解质可以帮助疏水蛋白质的溶解。还原性的DTT或DTE可以防止蛋白质氧化。一些蛋白酶在尿素和蛋白去垢剂存在下仍具有活性,蛋白酶抑制剂可以抑制大多数蛋白酶的活性。实际操作中,在样品中添加蛋白酶抑制剂混合物后对其进行蛋白提取,然后沉淀蛋白。

粗提物可能被盐离子、磷酸酯和核酸污染从而产生干扰或背景条带。银染后凝胶酸性区域内的横向条纹就是干扰的核酸。而且在IEF胶的碱性端,核酸会和蛋白质一起沉淀。核酸可以利用DNAsel、RNAseA或核酸酶去除,超声波可以将核酸打碎成小碎片,是最简单的处理方法。沉淀法同样可以除去核酸。脂类可以通过过量的去垢剂(>2%)或沉淀法去除。蛋白酶可以用沉淀法不可逆地灭活,固体可以通过离心去除,盐类可以通过透析或沉淀法去除。