FAQ-翻译后修饰

1. 在我的蛋白样品中比对磷酸化位点需要注意什么?

回答:你需要主要注意两点:1)覆盖度:你使用的质谱技术是否能够给出序列的高覆盖度?当序列覆盖度足够高时,统计学上讲就有更多机会检测识别到一个含有修饰基团的肽段。2)修饰率:制备的蛋白样品有多少比例被修饰了?如果这个比例较低,那么检测到修饰蛋白的概率就下降了。如果修饰率很高(>30%),那么这个样品就很适合用于检测修饰位点了。

2. 如何在匹配磷酸化和甲基化位点时提高序列覆盖度?

回答:首先,请注意因为蛋白的独有序列不同,每个蛋白得到高序列覆盖度的可能性各不相同。
可以通过以下手段提高所有蛋白的覆盖度:
a)用较多的蛋白来进行质谱分析(>5 μg的蛋白可以满足需要)。
b)确保蛋白纯净。
c)在分析中联用多种质谱仪器/技术可以提高覆盖度。
d)用TiO2柱富集磷酸化肽段。

3. 糖基化位点会影响样品蛋白的鉴定吗?

回答:如果蛋白的纯度和浓度够高,那么在大多数基于质谱的蛋白质鉴定中仍然是适合的。
具有糖链(CHO链)修饰的肽段,会因为以下几种机理影响特定肽段的质谱鉴定:
a)CHO链会阻断胰蛋白酶酶切。
b)CHO链的质量多样,会降低糖肽的鉴定。
可选:在跑胶和质谱分析前用N-糖苷酶(PNGaseF)酶切掉N-糖链。

4. 我想预分析一下我的蛋白样品中可能的磷酸化位点。你们最低的价格服务是什么?有什么限制?你们有什么建议?

回答:低价的预分析服务是利用凝胶或高纯度制备中抽提的纯蛋白进行MALDI-TOF/TOF分析。限制:如果蛋白很大或者纯度不够,或者量很小(<500 ng),覆盖度会较低。 建议:在预实验、低价分析中,只能提供高质量样品(样品在凝胶上只在1μg范围内出现一个条带)