蛋白质磷酸化

蛋白质磷酸化是发生最为广泛的共价修饰和最重要的调控修饰。该过程是可逆的,磷酸化/去磷酸化分别由激酶和磷酸酶催化,主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上。因其在细胞信号转导中扮演着关键角色,同时参与细胞周期调节、分化、转化、发育、肽荷尔蒙反应以及适应过程,也是研究最多最透彻的翻译后修饰。

Phosphorylation1

磷酸化蛋白质组学研究有哪些技术难点?

1. 磷酸化过程瞬时发生且可逆,对样品采集和保存的要求非常高;
2. 磷酸化蛋白质固有含量非常低,样品处理时采用高效的特异性富集手段非常必要的,同时还要考虑如何判断富集效率、特异性、回收率等;
3. 由于磷酸基团所引入的负电荷,修饰肽段更加难以离子化;
4. 磷酸化修饰和硫酸化修饰所产生的质量偏移非常接近,比如Phosphorylation :79.96633; Sulphation :79.95682。

定量磷酸化蛋白质组学实验流程

Phosphorylation2-1
Phosphorylation3

定量磷酸化蛋白质组学实验操作时需要注意的要点

样本前处理:实验操作低于4°C进行;所有buffer务必加入现配的蛋白酶/磷酸酶抑制剂等
富集策略:免疫亲和富集、TiO2富集、IMAC富集 (Fe3+, Ti4+)、亲水相互作用色谱/强阳离子交换色谱预分离等
定量方法:TMT/iTRAQ标记定量、非标定量等
二级质谱碎裂模式:CID、HCD、ECD、ETD、EThcD