蛋白质体外结合实验Pull-Down Assay

Pull-down Assay
Pull-down Assay

Pull-Down是一种体外实验,用于检测蛋白之间的物理互作。它可以用来验证通过其他技术手段发现的蛋白互相作用,并发现特定蛋白未知的相互作用。

Pull-Down实验类似于免疫沉淀(IP),但是使用诱饵蛋白来代替抗体作为亲和试剂。Pull-Down实验可以大幅提高蛋白纯化、发现潜在结合配体的速度和效率,特别是那些与诱饵蛋白牢固结合的蛋白。在Pull-Down实验中,诱饵蛋白经常用GST、polyHis或biotin标记,并用固定化亲和配体捕捉这些标记,如谷胱甘肽镍柱或链霉亲和素,形成“secondary affinity support”。这种固定了诱饵的secondary affinity support与生物样本孵育,捕获假定的靶蛋白。之后蛋白复合体经清洗去除非特异性结合。诱饵-靶蛋白互相作用的鉴定需要将复合体从secondary affinity support上分离,然后用诸如SDS-PAGE分析。但是SDS-PAGE的上样液可能会使样品中所有的蛋白变性。竞争性分析物洗脱特异性地应用于诱饵-靶蛋白的相互作用。

除了发现和验证蛋白之间的互相作用,Pull-Down实验同样是探测特定蛋白活性的有力工具。例如对酪氨酸磷酸化响应激活的蛋白,可以用固定化的SH2结构域进行Pull-Down,该结构域能够靶向蛋白中磷酸化的酪氨酸。该方法对探测特定蛋白是否活化具有很高的特异性。我们的技术团队可以在与您详细交流后提供专业的分析服务。