在当今生物科学研究和药物开发中，深入了解蛋白质之间的相互作用及其空间结构是至关重要的。为此，交联 质谱技术 （Cross-linking Mass Spectrometry, XL-MS）应运而生，该方法可以检测特定距离内的两个氨基酸，从而确定蛋白间的相互作用和互作位点，此外，还可以根据交联位点间的距离约束…
查看原始文章来源 ↗在当今生物科学研究和药物开发中，深入了解蛋白质之间的相互作用及其空间结构是至关重要的。为此，交联 质谱技术 （Cross-linking Mass Spectrometry, XL-MS）应运而生，该方法可以检测特定距离内的两个氨基酸，从而确定蛋白间的相互作用和互作位点，此外，还可以根据交联位点间的距离约束，推断蛋白结构或相互作用界。
接下来，将详细介绍交联质谱技术的核心原理、技术方案和优势以及其在结构生物学、药靶研究等方面的应用案例。
目标： 蛋白相互作用及其结合位点确定，复合物结构研究
研究材料： 客户提供的纯化蛋白/复合物
原理： 交联质谱是基于化学交联剂（小分子化合物）将空间距离足够近（~几纳米范围内）的两个特定氨基酸残基通过共价键链接起来，即发生交联反应，这些物理接近性可以指示蛋白-蛋白间的相互作用位点。
如上图实验流程所示，蛋白复合物在交联剂的作用下发生交联反应，即交联剂将距离很近的两个氨基酸连接起来，再通过蛋白酶切后会产生多种类型的肽段： mono-link， 交联剂只一端交联一条肽段； loop-link， 交联剂两端交联同一条肽段； Inter-link， 交联剂两端交联两条肽段； regular-link， 没有交联的常规肽段；以及多类型复合交联肽段。 经过质谱分析这些酶解产物后获得谱图数据，后续可以通过专业的软件鉴定出来交联肽段和交联位点。
交联质谱和邻近标记技术都是研究蛋白相互作用和结构的工具，而交联质谱的核心优势体现在空间分辨率上：交联质谱的空间分辨率非常高，能精确到具体的氨基酸残基，如下图所示的交联剂，可以捕获4nm距离内的两个氨基酸；相比之下，邻近标记的分辨率较低，标记的半径比较大（约10-20纳米）。
在应用范围方面，交联质谱尤为适合研究精确的蛋白质接触点和三维结构。蛋白 相互作用研究的一个难点是， 大多数蛋白质间相互作用持续时间很短且是非共价的。往往就是空间上相互碰一下，快速进行信号传导。交联试剂为这一问题提供了解决方案，即在蛋白质相互作用时瞬时将它们共价交联在一起，捕获蛋白质-蛋白质复合物，冻结短暂微弱的相互作用，从而实现对短暂相互作用和结构变化的表征。
备注：我们通常优先使用BS3或DSS交联剂，主要原因如下： 1）成熟的技术：技术参数和使用方法都已经很成熟。 2）标准化：标准化的流程和指南，便于研究人员遵循。3）广泛的适用性：大多数蛋白质复合体中赖氨酸的存在。4）商业化产品：易于获取且价格合理。5）文献支持：大量文献提供了丰富的数据支持和技术细节。
为了保证数据的可靠性，我们在前期会设置多个交联时间和浓度梯度，确保选取最佳交联条件的样品。后续酶解时我们采用溶液内酶解和胶内酶解两种方式，可以全面提高检测覆盖度，同时增强数据可靠性。最终我们会提供交联谱图、交联序列、交联位点、相互作用图，助力蛋白互作和复合物结构研究。
客户提供纯化蛋白/蛋白复合物，总蛋白量＞150μg，蛋白浓度＞1μg/μL。 注意蛋白为非变性状态。
交联质谱可以提供：1）详细的交联鉴定表。包括交联蛋白、交联序列及交联位点等信息，即，蛋白A的a位点和蛋白B的c位点交联，质谱检测有交联位点的蛋白，可能就是互作蛋白或者形成多聚体。2）交联肽段的高质量谱图。交联 肽段经过质谱高能碰撞解离后产生一系列肽段碎片离子，彩色标记的峰为质谱检测到的碎片离子，彩色覆盖越多，结果越可靠，因此是评估鉴定结果质量的直观方式。3）相互作用图。可视化蛋白相互作用位点，或复合物内部区域的交联情况。XL-MS 可与冷冻电镜等技术并行使用，以获取蛋白三维结构信息。
交联质谱在药物研发、结构生物学等领域具有广泛的应用价值。如果您正在寻找一种有效的方法来研究蛋白质相互作用和结构，交联质谱技术将是您的理想选择。以下我们将列举一些具体的应用案例：
文章题目： Structure of the voltage-gated& calcium channel Cavl.1 complex （ & Science ）& & &
研究对象： 电压门控钙通道Cav1.1复合物的结构解析。
交联质谱技术主要用于：
1. 确定Cav1.1复合物内蛋白质间的交联点，提供蛋白质相互作用的直接证据。
2. 辅助冷冻电镜数据解析，通过交联数据提供更准确的结构约束。
