生物体的生理病理过程大多是由 蛋白质 翻译后修饰启动的，这些修饰可以根据局部环境调节蛋白功能。翻译后调节的其中一种模式是通过内源性代谢或外源性刺激产生的活性氧/氮/硫(ROS/RNS/RSS)来实现的，这些物质通过半胱氨酸残基（Cys）的共价修饰来改变蛋白质功能。半胱氨酸上的硫具有多个氧化态（从-2到+6）,…
查看原始文章来源 ↗生物体的生理病理过程大多是由 蛋白质 翻译后修饰启动的，这些修饰可以根据局部环境调节蛋白功能。翻译后调节的其中一种模式是通过内源性代谢或外源性刺激产生的活性氧/氮/硫(ROS/RNS/RSS)来实现的，这些物质通过半胱氨酸残基（Cys）的共价修饰来改变蛋白质功能。半胱氨酸上的硫具有多个氧化态（从-2到+6）, 具有高亲核性且极易参与氧化还原反应（Redox）， 赋予了半胱氨酸化学上的“可变性”与功能上的“可调节性”。 有一种普遍观点认为 , 氧化还原的比例与其功 能性呈正相关 , 即只有当修饰比例较高时才能发挥对 蛋白质功能的调控作用 。因此，检测全蛋白组水平的半胱氨酸氧化还原比例 ，具有十分重要的生物学意义。
我们利用 一种基于亚磷酸基团的功能化巯基标记试剂（CPT），结合LC-MS/MS DIA技术，系统分析全蛋白质组水平的半胱氨酸氧化还原修饰比例。
参考文献：[Cell]& Haopeng Xiao, Mark P. Jedrychowski, Devin K. Schweppe, et al.,& A Quantitative Tissue-Specific Landscape of Protein Redox Regulation during Aging.& https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.012.
实验分为两个部分，第一个部分检测总半胱氨酸水平（背景组），第二个部分是检测半胱氨酸氧化水平（正式组），两者的比值即为半胱氨酸氧化修饰的比例。
CPT，带亚磷酸标签的半胱氨酸反应性试剂，可以特异性结合半胱氨酸上的巯基。为什么选择CPT试剂，主要有以下三个 原因：1）方法成熟，技术参数和使用方法都已经很成熟；2）标记效率高，接近100%，特异性好，结果更 准确； 3）半胱氨酸氧化修饰缺乏直接抗体或富集材料，而CPT试剂上带有磷酸标签，后续交换为对磷酸标签做磷酸化富集，方法非常成熟。
具体步骤：首先是背景组，先用CPT封闭/标记游离巯基，然后对所有 半胱氨酸 可逆氧化进行完全还原，还原后再用CPT进行标记，也就是成功标记了样本中的总半胱氨酸。而正式组是用IAM封闭游离巯基，然后对所有氧化位点还原和CPT标记，相当于仅标记了样本中的氧化半胱氨酸。之后进行酶解，用蛋白磷酸酶去除内源性磷酸肽，再用磷酸化 富集CPT标记肽段，最后通过 LC-MS DIA蛋白组技术定量氧化修饰/总半胱氨酸水平，计算比值获得半胱氨酸可逆氧化修饰比例。
每例样品要求至少可提取2 mg蛋白量。 我们可以接受各种样品，包括但不限于:
样本数量建议至少两组比较（实验组 vs 对照组），每组3个生物学重复，每个样本一式两份，一份进行背景组流程，另一份进行正式组流程，共12例上机数据。
研究半胱氨酸氧化修饰比例的重要意义，主要可以归纳为对 功能影响的全面理解：
如下图所示，假如我们不做背景组，不计算每例样本中的氧化修饰比例，只研究应激组和对照组间的氧化差异倍数，三个比较组（3组不同程度的应激vs对照）都发生了2倍差异变化，那么哪组实验的氧化程度更高呢，对蛋白功能的影响更严重？这就不清楚了。而当我们计算了每组样本的氧化比例后，可以清楚地发现对照组在应激处理后，分别由1%、10%、50%的氧化比例变化到了2%、20%、100%，很明显第三组的氧化程度更高，对蛋白功能影响更大，这对理解比较组间蛋白活性/功能是否发生了调控非常重要，对疾病机理和药物靶点研究都非常重要。
题目： A Quantitative Tissue-Specific Landscape of Protein& Redox Regulation during Aging
目的：通过计算半胱氨酸氧化修饰比例，比较年轻和衰老小鼠的器官特异性差异
设计：16周 vs 80周的小鼠器官，5个生物学重复，进行半胱氨酸氧化修饰比例蛋白组检测，组成小鼠氧化数据库（Oximouse）。样本收集了10种器官：脑、心、肝、脾、肺、肾、 骨骼肌、皮下脂肪、棕色脂肪组织、附睾脂肪。
结果：共定量到171,000个组织特异的半胱氨酸，匹配到9,400个蛋白质对应到34,000个unique位点。这些位点的数量达到了前人能检测到的几十上百倍，并且绝大多数位点从来没有被检测到过。
氧化修饰比例各组织覆盖度和特异性
对高氧化修饰比例（＞20%）的半胱氨酸蛋白质进行互作网络分析，大多数氧化还原网络显示出一定程度的组织选择性，并且通常与调节蛋白网络和代谢途径相关。例如，发现调节糖原和葡萄糖分解代谢的蛋白质网络的协同修饰在对快速糖原和葡萄糖利用非常重要的组织中富集。
各器官特异性的氧化还原调节网络
在比较老年小鼠和年轻小鼠时，尽管氧化还原蛋白质组在衰老过程中具有一致的大量群体特征，但对单个半胱氨酸的分析揭示了衰老和年轻组织内的氧化还原蛋白质组特征差异。最引人注目的是，在年轻组织中鉴定出的许多高度修饰位点在老化组织中丢失。有趣的是，这些年龄特异性特征也是组织特异性的。
