二硫键（-S-S-）的形成是由两个半胱氨酸上的巯基氧化形成的，对蛋白质的结构稳定性和功能至关重要。 二硫键是一个动态可逆变化的化学键，无论是断裂或是重新形成，均可调节蛋白质执行某种特定的功能，发生构象变化可能完全或部分失去原有的生物功能，也可能导致生物活性增强或出现新的功能。 二硫键广泛存在于细胞表面受体、抗体…
查看原始文章来源 ↗二硫键（-S-S-）的形成是由两个半胱氨酸上的巯基氧化形成的，对蛋白质的结构稳定性和功能至关重要。 二硫键是一个动态可逆变化的化学键，无论是断裂或是重新形成，均可调节蛋白质执行某种特定的功能，发生构象变化可能完全或部分失去原有的生物功能，也可能导致生物活性增强或出现新的功能。 二硫键广泛存在于细胞表面受体、抗体、生长因子、激素、酶等蛋白质中， 对其空间结构和生物学活性有着深远的影响。在生物药品的研发中，如单克隆抗体、ADC药物、重组和提取的蛋白药物，准确分析其二硫键的位置和数量是确保药物质量和效能的关键步骤。
目标： 绘制蛋白质所有二硫键的位置和数量， 对二硫键配对情况进行定位分析。
研究材料： 目标蛋白，客户寄送纯化蛋白或简单蛋白混合物，如单克隆抗体、ADC药物、重组和提取的蛋白药物等。
质谱分析二硫键的原理： 与传统蛋白质处理方法不同，检测二硫键通常是在非还原条件下，将游离巯基封闭，防止实验过程中二硫键发生错配，然后采用合适的蛋白酶进行酶切，得到链内交联或链间交联的二硫键肽段。接下来，通过高分辨高灵敏的质谱仪采集数据，并结合专业的分析软件对数据进行分析，从而得到二硫键的位置和数量以及配对信息。
上图比较了氧化和还原状态下的二硫键差异，左侧为未还原状态下的酶切肽段，保持了二硫键状态；右侧为还原后，二硫键打开的酶切肽段。
蛋白在非还原状态下，直接进行烷基化，目的是封闭游离巯基，防止实验过程中二硫键发生错配，
选择合适的酶进行酶解，保证肽段长度适合被质谱鉴定到，
选择高分辨高灵敏的质谱仪进行数据采集，尽可能鉴定二硫键肽段信息，
用专业的软件分析二硫键配对信息，或者比较实验组和对照组样本的二硫键差别。
方案一的优点是流程简单，成本低；缺点是可能鉴定不全。
在非还原状态下，先进行IAM烷基化，目的是封闭没有氧化的游离巯基，防止实验过程中二硫键发生错配，
还原，然后用NEM再次烷基化，目的是识别哪些发生了氧化，
用专业的软件分析二硫键，根据IAM和NEM之间的质量差，确定二硫键位点， 或者比较实验组和对照组样本的二硫键差别。
方案二的优点是能容易的确定哪些半胱氨酸是有二硫键；缺点是无法确定谁跟谁形成的二硫键。
每个样本一式两份，分别执行方案一和方案二流程 ，
用专业的软件分析二硫键的准确定位和配对信息， 或者比较实验组和对照组样本的二硫键差别。
方案三的优点是全面监测二硫键定位和配对信息，可监测对照组和实验组的二硫键动态变化；缺点是处理复杂、成本相对高。
如下图所示，展示了未还原状态和还原状态下的肽谱图，通过比较两个流程的LC 谱图来确定蛋白质的二硫键连接。
