为何要同时研 蛋白-磷酸 蛋白质是基因的表达产物，也是基因功能的执行者。相比基因或mRNA水平，评估蛋白质的活性和调控状态能更直观地揭示细胞功能的变化。磷酸化这个过程更有意思，它像是细胞内的“开关”，能快速调节蛋白质的功能， 因此理解磷酸化水平对生理病理研究很关键
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蛋白质是基因的表达产物，也是基因功能的执行者。相比基因或mRNA水平，评估蛋白质的活性和调控状态能更直观地揭示细胞功能的变化。磷酸化这个过程更有意思，它像是细胞内的“开关”，能快速调节蛋白质的功能， 因此理解磷酸化水平对生理病理研究很关键
结合蛋白质和磷酸化数据，可以确认 变化是否源于蛋白表达或功能状态改 即使蛋白质表达量未变，磷酸化差异仍可能反映关键的功能变化
为什么要开 微量蛋白-磷酸化技
样本量的限制：磷酸化蛋白组在样本制备时需要比常规蛋白组更大的量，然而在某些情境中，往往客户只有体积小、数量有限的微量样本，比 临床医学诊断获得的组织活检样本 ，如穿刺和切片等。微量样本能否兼顾磷酸化蛋白组检测？如何 低样本需 求和实验成本并提高检测覆盖度 我们 开发了微量磷酸化蛋白组 前处理技术
FFPE样本蛋白-磷酸化技术？
FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）样本是临床研究中最易获取和保存最多的材料。由于其可以很好地保存组织形态学 构，广泛用于组织学分析，是病理诊断和分类的金标准。据统计，全球有超过10亿个组织样本以FFPE形式保存在医院和生物样本库中，可用于回顾性研究，为疾病的发生、发展和治疗提供宝贵的数据
尽管FFPE 样本具有重要的价值，但在 蛋白质组 和磷酸化蛋白质组学研究中，FFPE样本存在一些挑战：福尔马林固定过程中，蛋白质会发生交联和降解，影响蛋白提取和分 离，因此我们 优化了前处理方法以提高蛋：肽段得率 ；另外，FFPE中蛋白质修饰可能会丢失，使得磷酸化修饰检测难度增加，因此我们 优化了磷酸化富集方法以提高磷酸肽的检测效
常规情况下，我们：00μg蛋白进行样品前处理及 200μg肽段 磷酸化富集，从蛋白变性、酶解、肽段纯化到富集全流程仅需4小时操作时间，再结合高通量高灵敏质谱实现高深度的磷酸化蛋白组检测。此外，常规全蛋白组检测需要至：0μg蛋白
尽管上述方案在成本、检测覆盖度方面都有很好的兼顾，但像我们前文提到的，在更低样本量的情况下，就需要开发更灵敏的方法。如下图所示，我们目前可对：00μg蛋白的珍贵样本同时进行磷酸化蛋白组和全蛋白组检测，80%的纯化肽用于富集和磷酸化蛋白组检测，剩下：0%纯化肽还可用于分析全蛋白组检测。该方法不仅灵敏，处理时间也同样高效，优化后仅需4h，并且与商业化试剂盒相比，鉴定结果更优
FFPE样本蛋白-磷酸化方
通过优化FFPE样本前处理和磷酸化富集方法，目前仅需一片FFPE切片就能同时完成蛋白：磷酸化蛋白组检测。首先采用FFPE试剂盒对样本进行前处理，包含提取蛋白、变性、酶解、脱蜡和除盐，试剂盒化操作可高效获得洁净上机肽段，减少样本损耗；然后10%的纯化肽直接用于全蛋白质组分析，剩余90%的纯化肽进一步进行磷酸肽富集，后续结合最新型质谱仪，实现极微量FFPE样本的深度磷酸化蛋白组检测
以下是采用常规方案的项目数据，对60例临床组织队列进行磷酸化蛋白组和全蛋白组检测，质谱为t imsTOF Pro2，DIA上机1 h，分级建库，Spectronaut搜库。结果共定量：4000+个磷酸化位点：600+个磷酸化蛋白，另外全蛋白鉴定：2000+个
磷酸化蛋白组需要进行磷酸化肽段富集后进行质谱检测，每例需要能得到0.3-1mg蛋白的原始样本。常规全蛋白组每： 需要能得到 20-100μg蛋白的原始样本
高灵敏蛋：磷酸化方案应用： 采集样品10组小鼠脑组织冷冻切片，每组脑切片具有独特脑区分布特征，涵： 小鼠 从大脑皮层到后脑的所有脑区，连续4张切片作为重复，：0例样： 均按照上述高灵敏方案进行 本制备，即每张小鼠脑切片：0%纯化肽用于富集，20%纯化肽用于全蛋白组分析，后续结合timsTOF质谱，DIA 60min上机检测
结果显示 平均每组小鼠脑区切片定量到近7000个蛋白，共定：1000+个磷酸化位点：9,429个磷酸肽。每组脑区的样本起始量不一样，最高不超过150μg，最值得强调的是，区 1的样本量最少，仅有 10μg肽量，文章从10μg肽中平均检测到4500+个磷酸化位点：000+个磷酸化肽。总一，该结果突出了我们的高灵敏方案可以对微量样本进行 深度和可 磷酸 全蛋白组同时分析
生信挖掘 对不同脑区的空间动态unique蛋白和磷酸蛋白进行整合分析，发现磷酸化的变化比蛋白组变化更明显，并且这些区域特征性磷酸化与神经变性和癌症相关，提示我们可以深入了解细胞调控在小鼠脑不同区域之间的相互作用，这有助于更全面地理解小鼠大脑的发展和活动过程
仅需：00μg蛋白，一片冷冻切片（：mm*5mm）即可同时检测蛋白组+磷酸化蛋白组
